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检测甲状腺肿瘤患者外周血及肿瘤组织中Th22细胞及白细胞介素-22

【摘要】 目的 检测甲状腺肿瘤患者外周血及肿瘤组织中Th22细胞及白细胞介素-22的表达水平,探讨其与患者临床病理特征的关系。方法 选择56例原发甲状腺肿瘤患者和30例健康志愿者,采用流式细胞仪检测外周血Th22细胞水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-22表达水平,应用免疫组化双染色分析正常组织及肿瘤组织中Th22阳性细胞的浸润程度,分析这些参数与临床病理特征间的关系。结果 甲状腺肿瘤患者外周血中Th22细胞及IL-22水平分别为(1.74±0.27)%和(162.7±32.2) ng/L,显著高于健康对照组[(0.57±0.14)%, t=15.72, P<0.01; (64.2±20.7) ng/L, t=11.31, P<0.01];甲状腺癌患者的Th22细胞比例及IL-22水平明显高于甲状腺瘤患者[(2.21±0.34%) 比 (1.39±0.22%), t=9.14, P<0.01; (199.1±34.1) ng/L 比 (129.8±31.3) ng/L, t=6.79, P<0.01]。甲状腺肿瘤患者组织中Th22阳性细胞高浸润率为56.25%,而对应正常组织为8.33%,差异有统计学意义(χ2=8.167, P=0.004);甲状腺癌患者组织中Th22细胞高浸润率为78.6%,甲状腺瘤患者组织为38.9%,差异有统计学意义(χ2=5.039, P=0.025)。外周血Th22细胞比例、IL-22的表达水平和肿瘤组织中Th22阳性细胞浸润程度与临床分期、淋巴结转明显相关(P<0.05),与年龄、性别、病理类型无明显相关(P>0.05)。结论 甲状腺肿瘤患者外周血Th22细胞比例及血浆中IL-22水平显著升高,且与临床分期等病理指标明显相关,表明Th22细胞及IL-22参与甲状腺肿瘤的发生发展。
【关键词】Th22细胞,白细胞介素22;甲状腺肿瘤
The abnormality and clinical significant of T helper 22 cells and interleukin-22 in patients with thyroid tumor
AbstractObjective To detect the expression of T helper cells 22 (Th22 cells) in the peripheral blood and the level of interleukin(1L)-22 in the plasma and the Th22 cells in the tumor tissues of patients with thyroid tumor, and to analyze the relationship between Th22/IL-22 and clinical characteristics in the pathogenesis of LSCC. Methods Fifty-six patients with thyroid tumor, and 30 healthy controls were included. Th22 cells in the peripheral blood were detected by flow cytometry, the concentrations of IL-22 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Double immunohistochemistry(IHC) was used to determine the Th22 cells in paraffin-embedded tissues, the relationship between Th22/IL-22 and clinical characteristics were analyzed. Results The level of Th22 cells in peripheral blood and IL-22 in the serum of patients with thyroid tumor were (1.74±0.27)% and (162.7±32.2) ng/L, respectively, significantly higher than that of healthy controls [(0.57±0.14)%, t=15.72, P<0.01; (64.2±20.7) ng/L, t=11.31, P<0.01]. Patients with thyroid carcinomas had higher Th22 cells and IL-22 levels than that of patients with thyroid adenomes [(2.21±0.34%) vs (1.39±0.22%), t=9.14, P<0.01; (199.1±34.1) ng/L vs (129.8±31.3) ng/L, t=6.79, P<0.01]. Compared with normal tissues, tumor tissues showed higher expression of CD4+IL-22+cells (56.25% vs 8.33%, χ2=8.167, P=0.004). Compared with adenome tissues, carcinoma tissues showed higher expression of CD4+IL-22+cells (78.6% vs 38.9%, χ2=5.039, P=0.025). The levels of Th22 cells in peripheral blood, IL-22 in serum and Th22 cells in tumor tissues was associated with tumor stage and lymph node metastasis (P<0.05). Conclusions There are higher quantification of Th22 cells and IL-22 in the peripheral blood and tumor tissues in patients with thyroid tumor and they have positive correlation with the clinical stage, Th22 cells and IL-22 may contribute to the disease progression and prognosis of thyroid tumor.
Keywords】Th22 cells; Interleukin-22; Thyroid tumor
Th22细胞是最近发现的辅助性T细胞新亚群,表达CCR6、CCR4和CCRl0,产生IL-22和IL-13,但是不产生IFN-γ、IL-4和IL-17,是独立于Th1、Th2和Th17的细胞亚群[1]。Th22细胞主要参与自身免疫性疾病、感染性疾病等的免疫调节[2, 3]。最近研究证实,Th22细胞及其效应细胞因子IL-22在多种肿瘤组织中分布和表达,但是其在肿瘤中的确切作用及其机制还有待深入研究[1]。我们通过检测甲状腺肿瘤患者外周血及肿瘤组织中Th22细胞及IL-22的表达水平,分析其与甲状腺肿瘤患者临床病理特征的关系,探讨Th22细胞及IL-22在甲状腺肿瘤发生发展中的免疫学作用。
资料与方法
  1. 一般资料 收集2011年9月至2014年9月在温州市中心医院内分泌科接受治疗的56例原发甲状腺肿瘤患者标本,其中男21例,女35例,年龄21~54岁,中位年龄37.2岁。健康对照组为温州市中心医院体检中心的健康志愿者30例,其中男13例,女17例,中位年龄35.2岁(25~61岁)。所有患者签署知情同意书,采血或取组织标本前未经任何抗癌、抗炎及激素治疗,并排除自身免疫性疾病。所有的组织标本病理类型均经过病理科证实,其中甲状腺瘤37例,甲状腺癌19例。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IL-17抗体、藻红蛋白(PE)标记的抗人IL-22、甲藻素叶绿素蛋白/青色素染料5.5 (Percp-Cy5.5) 标记的抗人IFN-γ抗体、藻红蛋白/青色素染料7 (PE-Cy7) 标记的抗人CD3抗体,别藻蓝蛋白(APC)标记的抗人IL-4抗体、别藻蓝蛋白/青色素染料7 (APC-Cy7) 标记的抗人CD4抗体以及IL-22 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国eBioscience公司;佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、莫能霉素(Monensin)购自碧云天生物技术有限公司;RPMI-1640培养基购自Hyclone公司;固定剂、破膜剂购自美国BD公司;淋巴细胞分离液购白天津灏洋生物制品科技有限公司;鼠抗人CD4单克隆抗体、兔抗人IL-22多克隆抗体及同型对照抗体购自美国abcam公司;免疫组化SP双标记法染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;流式细胞仪(型号FACS Canto)为美国BD公司产品,二氧化碳孵育箱购自美国Thermo公司,酶标仪为美国BioTek公司产品。
  1. 标本采集:早晨空腹留取各受试对象肝素钠抗凝静脉血2 ml,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),用PBS洗涤细胞2次备用,同时采1ml无抗凝静脉血,离心后留取血清保存于-80℃冰箱中冻存。取32例甲状腺肿瘤患者(其中甲状腺癌14例)术中病变组织及其瘤/癌旁相对正常组织(尽可能远离病变组织取材),标本经多聚甲醛固定后制成石蜡切片。
  2. 细胞染色及流式细胞仪分析:将分离出来的外周血单个核细胞用1ml RPMI-1640调整细胞浓度至1×106/ml,接种于24孔培养板后,加入刺激剂PMA 50ng/ml、Ionomycin 500ng/ml和Monensin 10μg/ml,在37℃、5% CO2细胞培养箱培养4h后取出,以PBS洗涤2次。每1×106/ml细胞中加入PE-Cy7标记抗人CD3和APC-Cy7标记抗人CD4 各20μl,避光孵育30 min。随后进行细胞固定、破膜,进行胞内染色,加入FITC标记的抗人IL-17抗体、PE标记的抗人IL-22、PE-Cy5.5 标记的抗人IFN-γ抗体、APC标记的抗人IL-4抗体各2.5μl,4℃避光孵育30 min,PBS洗涤2次后,加人200μl染色缓冲液后上机检测。将CD3+CD4+IFN-γ-IL-4-IL-17-IL-22+T细胞定义为为外周血Th22细胞。
  3. 酶联免疫吸附实验检测血清中IL-22的水平:采用IL-22 ELISA试剂盒检测血清中IL-22的表达水平,操作过程严格按产品说明书进行,实验中设计空白对照组和阴性对照以保证检测结果的可靠性,所有样本均设置复孔。
  4. 免疫组化SP双标记法检测组织标本中Th22细胞的表达:组织标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片厚4μm,按照试剂盒说明书操作进行免疫组织化学双染。结果判定:CD4+IL-22+细胞的判定以胞膜呈棕黄色和(或)棕褐色、胞质呈红色为阳性表达。用奥林巴斯光学显微镜及Image-Pro Plus V6.0图像分析软件40倍物镜下,按照Kuang等[4]方法由不知分组资料的2位病理科医生进行盲法阅片:首先在低倍视野(4×10)下选取细胞分布均匀的区域,然后在高倍视野(High power field HPF)(40×10)下进行阳性细胞计数,随机计数5个高倍视野(HPF)(40×10)的阳性细胞数目,取平均值以阳性细胞数/HPF表示。染色结果分析:细胞数<1为(-),1~5为(+),6~19为(++),≥20为(+++),以(-)(+)为低浸润,(++)(+++)为高浸润。
  5. 统计学方法:数据采用均数±标准差( +S)来表示,应用SPSS16.0统计软件分析。组间均数的比较采用t检验,率的比较采用χ2检验,相关分析采用Spearman秩和相关分析。

  1. Th22细胞及IL-22在甲状腺肿瘤患者外周血中的表达:甲状腺肿瘤患者外周血中Th22细胞及IL-22水平明显高于健康对照组(t=15.72, P<0.01; t=11.31 P<0.01),甲状腺癌患者的Th22细胞比例及IL-22水平明显高于甲状腺瘤患者(t=9.14, P<0.01; t=6.79, P<0.01),结果见表l。IL-22是Th22细胞分泌的特征性细胞因子,也是Th22细胞发挥效应的功能性细胞因子,直线相关分析表明,甲状腺肿瘤患者外周血Th22细胞百分比与血清中IL-22水平呈正相关( r=0.67, P=0.014)。
表1甲状腺肿瘤患者与健康对照组外周血Th22细胞及IL-22的比较( +S)
组别 例数 Th22细胞(%) IL-22 (ng/L)
健康对照组 30 0.57±0.14 64.2±20.7
甲状腺肿瘤患者 56 1.74±0.27* 162.7±32.2*
甲状腺瘤 27 1.39±0.22* 129.8±31.3*
甲状腺癌 19 2.21±0.34*# 199.1±34.1*#
注:与健康对照组比较,*P<0.01;与甲状腺瘤期比较,#P<0.01
 
  1. Th22细胞在甲状腺肿瘤患者组织中的表达:Th22细胞在正常组织中几乎不表达,在甲状腺肿瘤组织中阳性细胞主要位于癌周间质,很少分布于癌组织中。甲状腺肿瘤患者组织中Th22阳性细胞高浸润率为56.25%(18/32),而对应正常组织为8.33%(1/12),差异有统计学意义(χ2=8.167, P=0.004)。甲状腺癌患者组织中Th22细胞高浸润率为78.6%(11/14),甲状腺瘤患者组织为38.9%(7/18),差异有统计学意义(χ2=5.039, P=0.025),结果见表2。
表2甲状腺肿瘤患者组织中Th22细胞浸润程度比较(%)
组别 CD4+IL-22+T细胞水平
总例数 高浸润N(%) 低浸润N(%)
正常组织 12 1(8.33%) 2(16.7%)
甲状腺瘤组织 18 7(38.9%) 11(61.1%)
甲状腺癌组织 14 11(78.6%) 3(21.4%)
 
  1. Th22细胞和IL-22的表达水平与临床病理特征之间的关系:外周血Th22细胞和IL-22的表达水平与甲状腺肿瘤患者的临床分期、淋巴结转明显相关(P<0.05),与其他病理特征无明显相关(P>0.05)。肿瘤组织中Th22阳性细胞浸润程度与临床分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05),与其他临床病理特征无明显相关(P>0.05)。结果见表3。
表3. Th22细胞和IL-22的表达水平与甲状腺肿瘤临床病理特征之间的关系
临床病理特征 Th22细胞水平 IL-22水平
(ng/L)
Th22阳性细胞水平
例数 (`x±SD) (`x±SD) 例数 高浸润
(n)
低浸润
(n)
年龄            
<40岁 30 1.73±0.27 157.5±39.7 17 10 7
≥40岁 26 1.79±0.21 164.1±29.1 15 8 7
性别            
21 1.83±0.14 167.5±44.2 12 6 6
35 1.64±0.22 154.9±27.2 20 12 8
病理类型            
乳头状癌 9 2.29±0.37 212.8±31.9 7 6 1
滤泡状癌 5 2.19±0.31 204.6±39.7 4 3 1
未分化癌 5 2.24±0.33 198.4±35.1 3 2 1
淋巴结转移            
39 1.71±0.30 159.2±36.1 21 8 13
17 2.77±0.27 227.6±28.7 11 10 1
临床分期            
Ⅰ-Ⅱ期 37 1.81±0.29 161.3±35.3 20 8 12
Ⅲ-Ⅳ期 19 2.56±0.22 210.5±28.4 12 10 2

甲状腺肿瘤是临床常见病,多发病,其中绝大多数为良性病变,少数为肉瘤、癌等。近年来甲状腺肿结节的恶变率逐渐升高,但是恶变的机制目前还是不清楚。肿瘤的发生发展与肿瘤细胞逃避机体免疫监视有关,肿瘤微环境中的免疫细胞及相关免疫因子可能决定着这个肿瘤的恶性转规及预后。因此,检测甲状腺各种病理类型肿瘤组织内与外周血的相关免疫细胞和免疫因子的变化,对研究甲状腺肿瘤恶变机制及其与机体免疫系统的关系具有重要意义。
2009年,Trifari[5]和Duhen[6]分别报道了一群特征性分泌IL-22的CD4+T细胞新亚群,并命名为Th22细胞,这群细胞表达CCR6、CCR10和CCR4,分泌IL-22,但是不产生IFN-γ、IL-4和IL-17,是独立于Th1、Th2和Th17的细胞亚群。这群细胞主要参与皮肤的自稳调节和病理状态。近年来的研究表明在肝癌[7]、胃癌[8]、肠癌[9]及白血病[10, 11]等多个系统肿瘤的外周血和肿瘤组织中均发现了Th22细胞及IL-22的存在,并可成为评估肿瘤疗效、判断预后及指导治疗的有效指标[8],但是关于Th22细胞肿瘤发生发展中的作用,目前结论不一。本研究结果显示甲状腺肿瘤患者外周血Th22细胞的水平较健康对照组明显增多,并且甲状腺癌患者Th22细胞的水平较甲状腺瘤患者显著增多,提示随着肿瘤的恶变,Th22细胞也随之增加。本研究结果显示作为Th22细胞的效应细胞因子,血清中IL-22的水平也较健康对照组多,并且随着肿瘤的恶变,IL-22的水平也增多,直线相关分析显示甲状腺肿瘤患者外周血Th22细胞水平与相应患者血清IL-22水平呈正相关。同时外周血Th22细胞和IL-22的表达水平与临床分期和淋巴结转有关,而与年龄、性别、病理类型等临床特征无关。这些结果表明提示Th22细胞的增多可能是甲状腺肿瘤发展和恶变的重要原因。许秀华[7]等研究发现乙肝相关性原发性肝癌患者外周血Th22细胞明显高于肝硬化患者和健康人,同时肿瘤直径与Th22细胞呈显著正相关,表明Th22细胞原发性肝癌的发病和进展过程,与本研究结论相符。Liu[12]等的研究结果显示,胃癌患者体内也存在高水平的Th22细胞,与正常对照组相比,胃癌患者术前外周血中Th22细胞水平明显增高,且Th22细胞百分比和IL-22水平与胃癌患者的病理TNM分期有关,同时Th22细胞水平与胃癌患者总体生存率成反比。这些研究结果表明Th22细胞与肿瘤的进展密切相关。
肿瘤微环境是肿瘤发生发展中所处的内环境,主要包括细胞(肿瘤细胞、免疫细胞、炎症细胞、内皮细胞等)、细胞外基质和细胞外分子,肿瘤细胞和肿瘤微环境中的其他成分之间的相互作用是肿瘤发生发展的决定因素。鉴于以上研究发现甲状腺肿瘤患者外周血中Th22细胞及IL-22的水平显著升高,并且与临床分期密切相关,提示Th22细胞及IL-22可能参与了甲状腺肿瘤的发生发展过程。因此我们应用免疫组化双染的方法检测了Th22细胞在甲状腺肿瘤患者组织中的表达水平。本研究结果显示Th22细胞在正常组织中几乎不表达,在甲状腺肿瘤组织中阳性细胞主要位于癌周间质,很少分布于癌组织中。肿瘤组织中Th22细胞高浸润率显著高于正常组织,并且其浸润程度与临床分期、淋巴结转移密切相关,甲状腺癌组织患者Th22细胞高浸润率为78.6%(11/14)%,显著高于甲状腺肿瘤患者38.9%(7/18)。癌组织Th22细胞浸润程度与区域淋巴结转移状况也有关,有转移患者癌组织Th22细胞高浸润率为91%(10/11),显著高于无转移者38.1%(8/21)。以上结果提示Th22细胞可能作为甲状腺肿瘤患者肿瘤微环境中抗肿瘤免疫的抑制性细胞因子而参与了肿瘤组织与免疫系统之间的相互作用。Zhang[13]等研究表明,IL-22在肿瘤组织、恶性胸腔积液和人非小细胞肺癌(NSCLC)血清中均高表达,提示IL-22与人类NSCLC发生发展密切相关。进一步研究发现,IL-22在人类NSCLC中高表达且通过自分泌的方式增强其抗细胞凋亡作用,这一作用是通过活化肿瘤细胞和基质细胞的STAT3信号通路及其下游的抗细胞凋亡蛋白,促进这些细胞抗凋亡基因的表达来实现的。
本研究结果表明,甲状腺肿瘤患者外周血Th22细胞比例及血浆中IL-22水平显著升高,且与临床分期等病理指标明显相关,它提示Th22细胞及IL-22参与甲状腺肿瘤的发生发展。
参考文献                        
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本文选自温州一枝笔写作事务所:专业代写毕业论文-致力于医学论文职称论文代写代发论文(责任编辑:yzbcc)
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